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Think Hybrid.

Research

人工細胞

【概要】
 我々を構成している基本単位は細胞です。大きさは約10ミクロン。日本人の髪の毛の直径は大体100ミクロンですから、その大きさは目には見えないほど小さなものであることがわかるでしょう。この1つの細胞の中に、さまざま機能を持つ要素が集約されています。また、それらは、分裂することによって成長しています。
 工学者の目から見て、このような細胞の内外の情報伝達がどのようにされているかは非常に気になるところです。また、細胞のような機能を人工的に再現できればすばらしいことです。このような研究分野では、リポソームと呼ばれる人工細胞膜が活躍しています。細胞膜と同じ脂質2重層でできた球体なのですが、最近、この中に、細胞内で活動する生体分子や、マイクロマシンニングで製作した人工の微小構造を閉じ込め機能させることができるようになってきました。
 本研究室では、微小電極が配置されたマイクロ流体システム上で、このリポソームの直径を制御したり、効率よく物質を内包したり、顕微鏡下で電気的に位置をコントロールしたり、2つのリポソームを一つに融合させるような実験をしています。最近では、バクテリアの鞭毛を取り付けてあたかも生物のように動かすことができるようになってきました。直径がナノからマイクロサイズまで、比較的自由に変えられるので、非常に小さな空間を作り出せます。たとえば、直径1ミクロンのリポソームの体積は1フェムトリットル(フェムトは10の-15乗)です。このような、容器に、反応性の物質を閉じ込めることで、反応によって合成された物質の濃度を急激に上昇させることができます。すなわち、短時間で物質を検出できるというわけです。これらの膜構造を利用して、2液を反応させたり(写真)、その位置を制御するような研究を行っています。
 また、これらの研究は、学術的にも大きな意味があります。何十億年も前に、おそらく分子の自己組織的な現象がいくつも組み合わさって最初の生命、つまり最初の細胞ができたはずです。その瞬間を観てみたいというのは、多くの科学者の夢でもあります。工学者は、生物の魅力的なシステムにあこがれ、これを人工的に創り出したいと思い、生物学者は、再構成することで解る生命の真理を導き出したいと意欲を燃やしています。試行錯誤を繰り返し、形から反応、動きまでを再構築し、どのようにして生命が誕生したか探る研究は、細胞を創る研究の醍醐味でもあり、「生命とは何か」を知る営みでもあります。

動くリポソーム:鞭毛によって駆動するリポソームやマイクロビーズの運動解析

 細胞の分裂、移動などの運動は、生体分子モータと呼ばれるタンパク質によってなされている。生体分子モータには、アクチン-ミオシン、微小管-キネシン(あるいはダイニン)などのリニアモータや、ATP合成酵素などの回転モータなどが存在する。大きさはおよそ10 nmであり、工学者から見れば、まさにナノサイズのアクチュエータである。このようなアクチュエータを、下のようなリポソーム生成技術と融合させると、動くリポソームを作製することができる。
 一例として、われわれは、クラミドモナスと呼ばれる微生物の鞭毛を切り出し、リポソームに取り付け実験を行った。この鞭毛は微小管-ダイニンからなるリニア分子モータからなり、各分子モータが滑り運動をすることによって、波打つような鞭毛運動が得られる。このようなアクチュエータを球形のどの部分にどのように結合させれば、推進力が得られるか右図のようなモデルを作り解析を行った。また、実際にマイクロビーズに鞭毛を固定し、推進力がどのように生じるか解析した。
 さらに、この鞭毛の根元をリポソームとアビジン-ビオチン結合によって吸着させると、右の動画のようにリポソームが鞭毛運動によって、回転する様子が観察された。ここで得られた動きはランダムであるが、最近では、膜の流動性をおさえることで鞭毛の推進力をより強めることができるようになってきた。鞭毛を得ることで単なるブラウン運動よりも圧倒的に広範囲に運動することができる。もちろん、細胞のように走行性を持つ動きは現時点で実現できていないが、将来、膜タンパクからの信号を鞭毛運動にフィードバックできるようになれば、信号源に集まるリポソームができるかもしれない。

Nobuhito Mori et al.:Applied Physics Letters, 2010 [movie: a liposome with flagellum],[movie: a bead with flagellum],

マイクロ流路による細胞サイズの均一ベシクル作製法

 我々が考案した膜チャンバを発展させ、細胞サイズの均一直径ベシクルを形成することに成功した。各チャンバの底面に微小な流路を設け、脂質膜の形成後に、微小流路から主流路へ向けて流れを発生させる。すると、膜が変形し、主流路のせん断応力によって分離し、ベシクルとなることが分かった。実験の結果、均一直径のベシクルを大量に得ることができた。さらにこれらのベシクルにα-ヘモリシンを導入後、ベシクル内のカルセインが外部に放出される様子を観察することができたことから、これらのベシクルが単層の脂質2重膜を有することが示された。下記のシャボン玉法は平均直径が100ミクロンオーダであり、扱いが難しかったが、本手法によるベシクルは約10分の1の直径で形成できることかたら寿命も長く、細胞内現象を模擬した実験系に利用できると考えている。
 マイクロ流体デバイスでは、このようなT-junctionを利用した研究は多い。それらの場合、主流路に有機溶媒(Oil)、微小流路に水溶液(Water)を導入し、均一直径の液滴エマルジョン(W/Oエマルジョン)を形成している。一方、ここで示した方法は主流路、微小流路とも水溶液であり、微小流路内に含まれる水溶液の物質を効率よくベシクルに内包できるのが特徴である。

Ota et al, Angewandte Chemie International Edition, vol. 48, pp. 6533-6537, 2009, [Press],, (highlighted in Nature Chem. and Lab. Chip)

シャボン玉法によるベシクル生成

われわれの開発した接触法(膜タンパク質チップ参照)は非常に安定して、再現性のある脂質2重平面膜の形成方法です。ここでは、この方法で作製した膜に微小なガラス管を近づけ、ジェット水流を吹き付けます。すると、右図のように、平面膜が変形し、球体の膜を形成できるようになります。この方法を利用すると、直径がほぼ一様なカプセルを多数作ることができます。また、 DNAや酵素、あるいは細胞抽出液などを簡単にカプセル化することができるため、人工細胞研究の強力なツールになると考えています。

Kei Funakoshi, Hiroaki Suzuki, and Shoji Takeuchi: Formation of giant lipid vesicle-like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow, Journal of the American Chemical Society, vol. 129, pp. 12608-12609, 2007

マイクロ流路チャネルを用いたジャイアントリポソームの作製

異なる種類のジャイアントリポソームを同時に効率よく作製する方法として,マイクロ流路内で,エレクトロフォーメーション法により作製する方法を検討しました.マイクロ流路を用いることは、以下のような利点があります.
1) 薬品やDNAなどの貴重な試料を少量,効率よくリポソーム内に閉じ込めることができます.
2)いくつかの流路を持つことにより,同一基板上に異なる種類のリポソームを同時に作ることができます.シリコーンゴム製のマイクロチャネルをリン脂質膜がついた透明電極ガラスプレート(ITO)で挟み,水溶液をチャンネルに注ぎます.その後、電圧AC(0.5-1.5 V, 10 Hz)を印加すると,リン脂質膜が基板から剥離され,マイクロチャンネル内のみでリポソームが作製されます.溶液中にDNAやタンパクを模擬したマイクロ・ナノサイズのビーズを加えることにより,リポソーム中にこれらの物質を閉じ込めることができます.結果、同一基板上にマイクロ・ナノサイズのビーズをそれぞれ包み込んだジャイアントリポソームを同時に作ることができました.
(K. Kuribayashi et al., 2006, Meas. Sci. Technol. 17: 3121-3126, Transducers05, pp. 1159-1162, 2005 6

細胞サイズの脂質2重膜カプセル”リポソーム”

我々を構成している基本単位は細胞です。その大きさは約10ミクロン程度。日本人の髪の毛の直径は大体100ミクロンですから、その大きさは目には見えないほど小さなものであることがわかるでしょう。この1つの細胞の中に、さまざま機能を持つ要素が集約されています。また、それらは、分裂することによって成長しています。工学者の目から見て、このような細胞の内外の情報伝達がどのようにされているかは非常に気になるところです。また、細胞のような機能を人工的に再現できればすばらしいことです。このような研究分野では、リポソームと呼ばれる人工細胞膜が活躍しています。細胞膜と同じ脂質2重層でできた球体なのですが、最近、この中に、細胞内で活動する生体分子や、マイクロマシンニングで製作した人工の微小構造を閉じ込め機能させることができるようになってきました。本研究室では、マイクロ流路システムを用いて、リポソームの位置をコントロールしたり、2つのリポソームを1つに融合させるデバイスの開発、細胞と同様の大きさのリポソーム(特にジャイアントリポソームと呼ぶ)を効率よく作製することができるマイクロデバイスの開発を行っています。

リポソームのエレクトロフュージョン(電気的融合)

 高アスペクト比のシリコン電極間に微小電圧をかけることによってリポソームや細胞のエレクトロフュージョンを実現しました。このマイクロデバイスはガラス基板に250μmの薄さのシリコン電極をボンディングし、その後PDMSでコートされたスライドガラスで覆うような構成になっています。まず、300kHzの交流電圧をかけることでリポソームを配列し、その後短い直流パルス電圧をかけることでフュージョン(融合)させます。この方法によって、フュージョン成功率を75%に向上させることができました。また、特に10μmより大きな直径のリポソームに対して有効に作用することが分かりました。さらにマイクロビーズを閉じ込めたリポソーム同士のフュージョンにも成功しています例えば、現在は生細胞に微小な人工物や遺伝子を低侵襲で効率的に導入する方法に応用できます。

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